甜菜夜蛾RNAi害虫控制的潜在靶标基因筛选和风险评估

【摘要】甜菜夜蛾(SpodopteraexiguaHubner),是一种危害严重的世界性害虫。研究表明,通过dsRNAs或siRNAs沉默害虫的重要基因是一种可行的害虫防治方法,RNAi介导的害虫控制的第一步是筛选出合适的靶标基因。为了研究RNAi技术在甜菜夜蛾控制中的应用,本论文首先根据基因在细胞代谢过程中的重要性,从甜菜夜蛾转录组数据中筛选出9个基因,研究了这些基因被干扰后对甜菜夜蛾的致死效果,同时开展了脱靶效应检测和安全性评估,为安全有效地利用RNAi技术进行甜菜夜蛾防治提供了依据。1.甜菜夜蛾RNAi害虫控制的潜在靶标基因全长克隆根据玉米根叶甲中已知的害虫控制靶标基因和基因在细胞代谢过程中的重要性,从甜菜夜蛾转录组数据中,筛选出9条甜菜夜蛾RNAi害虫控制靶标基因,分别为ADP-ribosylationfactor1(arfl),ADP-ribosylationfactor2(arf2),tubulin1,tubulin2,chitinase1,chitinase7,plasmaglutamatecarboxypeptidase(PGCP),helicase和ATPase基因。利用RACE技术,成功克隆得到6个基因(arfl,arf2,tubulin2,chitinase7,PGCP,helicase)的5’UTR,但只克隆得到arf2基因的3’UTR。将5’UTR.3’UTR序列与转录本序列进行拼接,其中5个基因(arf1,arf2,tubulin2,chitinase7,helicase)有完整的CDS区,arf2基因得到全长。9条基因与其他昆虫物种的同源基因具有很高的相似性,并已将9条基因序列提交到NCBI数据库。2.甜菜夜蛾RNAi害虫控制的潜在靶标基因RNA干扰根据9条基因的序列,设计siRNA,将2μlsiRNA(2μg/μl)主射到4龄幼虫体内进行RNA干扰,利用qRT-PCR检测RNAi勺效率。结果显示,与对照相比,靶标基因的mRNA丰度均有不同程度的下降(～20%-94.3%)。同时8个基因(chitinase7,PGCP,chitinasel,ATPase,tubulin1,arf2,tubulin2和arfl)在被干扰后,死亡率显著升高,其中PGCP-siRNA,chitinase1-siRNA,tubulinl-siRNA,tubulin2-siRNA和helicase-siRNA实验组中约80%的存活个体出现发育迟缓,chitinase1-siRNA和chitinase7-siRNA实验组中12.5%的存活个体出现半蜕皮现象,arfl-siRNA和arf2-siRNA实验组中15%的存活个体在注射siRNA48h后出现体色变黑的现象。3.甜菜夜蛾RNAi脱靶分析根据甜菜夜蛾RNAi实验,选取chitinase1和arf2基因分别进行了RNAi脱靶效应分析。在分别沉默chitinase1和arf2基因后,对其进行DGE(DigitalGeneExpressionProfiling)分析和qRT-PCR检测。主要检测了三类非靶标基因,第一类是与chitinasel和arf2基因的siRNA有不同连续匹配的非靶标基因,第二类是与chitinase1、arf2基因同源的非靶标基因,第三类是chitinase1、arf2基因所涉及的代谢通路中的其它基因,结果显示这三类非靶标基因的表达量均有小部分发生显著性上调或下调,第一和第二类可能是由于脱靶效应引起的,但第三类可能是代谢通路中的目标基因被干扰后的连锁反应。4.甜菜夜蛾siRNA对家蚕的影响分析以家蚕为实验对象,将甜菜夜蛾RNAi实验中的chitinase1和arf2害虫控制靶标基因的siRNA注射到家蚕体内,进行安全性评估。qRT-PCR检测结果表明,RNAi后,在家蚕中与甜菜夜蛾chitinase1和arf2基因的siRNA有不同连续匹配(7,9,11,13,15,16)的非靶标基因和与之同源的非靶标基因的相对表达量有不同程度的上调或下调,但家蚕的生长发育没有受到任何的影响。
【作者】李航；
【导师】李飞；
【作者基本信息】南京农业大学，农业昆虫与害虫防治，2013，硕士
【关键词】甜菜夜蛾；RNAi；siRNA；全长克隆；脱靶效应；安全性评估；

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